Апоптоз физиологические и патологические причины. Апоптоз клеток: можно ли замедлить старение организма? Механизм активации апоптоза
13195 0
Апоптозом (от греч. apoptosis — опадание) названо явление программируемой гибели клетки, сопровождаемой набором характерных цитологических признаков (маркёров апоптоза) и молекулярных процессов. Термин введён А. Керром с соавторами (Kerretal, 1972). Принципиальным отличием апоптоза от некроза является то, что первый сопровождается характерным каскадом реакций процесса элиминации клетки, а некроз есть результат незапланированного события и происходит спонтанно (Harmonetal., 1998) (рис. 1).
Рис. 1. Схема ультраструктурных изменений клетки при апоптозе и некрозе, предложенная лабораторией специальной микроскопии Донецкого ГМУ
Характерный каскад процессов при апоптозе включает: (а) конденсацию хроматина, (б) разрушение ядра, (в) вспучивание плазматической мембраны, (г) фрагментацию клетки с образованием дискретных апоптозных тел (АпТ). Апоптоз может быть вызван как внешними воздействиями (например, ядами), так и внутриклеточными сигналами, включая активацию «генов смерти». При этом механизмы апоптоза могут быть не только запрограммированными, но и спонтанными (Фильченков, Стойка, 1999).
Апоптоз в эволюции появился, по-видимому, вместе с появлением эукариотных многоклеточных организмов для регуляции численности клеток и установления между клетками в организме определенных взаимоотношений. Клетки взаимодействуют на разных стадиях жизненного цикла, например, при делении, росте, дифференцировке и гибели. Исследование молекулярных механизмов гибели (запрограммированной?) клетки стало в последние годы одной из самых трудных и актуальных проблем биологии.
Проблема апоптоза в настоящее время вызывает повышенный интерес со стороны специалистов разных научных дисциплин. Активацией апоптоза объясняют протекание СПИД, заболеваний локомоторного аппарата, нервной системы, болезней Вильсона, Паркинсона, Альцхаймера и Гетчинсона (прогерия , преждевременное старение). Вероятно, по механизму апоптоза отмирают клетки при ишемии мозга и инсульте, а также при анемиях (Белушкина, Белецкий, 2004).
В здоровом организме в норме в разных процессах также происходит удаление клеток путем апоптоза. Например, при росте и развитии организма. В процессе развития ЦНС нейронов образуется больше, чем необходимо, лишние удаляются. Апоптоз необходим также для реализации иммунного ответа. Один из механизмов защиты предполагает существенное увеличение количества лимфоцитов, которые при внедрении чужеродных микроорганизмов продуцируют антитела. После уничтожения этих микроорганизмов большинство таких специфических клеток соединительной ткани уничтожаются; таким образом, механизм удаления ненужных клеток необходим для выживания организма.
Этот механизм действует также при атрофии клеток под действием цитокинов (фактор некроза опухоли), при вирусных заболеваниях (например, при синдроме приобретенного иммунодефицита — СПИД), при нейрогенеративных заболеваниях. Недостаток апоптоза приводит к раку и другим опухолям; его избыток приводит к потере клеток. В молодом возрасте апоптоз является полезным, в дальнейшем он участвует в процессах старения.
Определены некоторые признаки апоптоза, отличающие его от некроза:
- фосфатидилсерин из внутреннего слоя цитоплазматической мембраны перемещается в наружный;
- цитохром с из межмембранного пространства митохондрий выходит в цитоплазму; активируются цистеиновые протеиназы (каспазы );
- увеличивается образование активных форм кислорода (АФК); цитоплазматическая мембрана сморщивается, а объем клетки уменьшается;
- нити ядерной ДНК в межнуклеосомных участках разрываются, хроматин конденсируется по периферии ядра, которое затем распадается на части;
- клетки фрагментируются на везикулы с внутриклеточным содержимым (апоптотические тельца ). В отличие от некроза, в случае апоптоза целостность цитоплазматической мембраны сохраняется до поздних стадий процесса, несмотря на сморщивание.
Выявлены некоторые молекулярные процессы, наблюдаемые при апоптозе:
1) действие Са 2 + и Zn 2 + (главных неорганических мессенджера и гормона , соответственно), имеющее взаимно антагонистический характер,
2) изменение мембранных белков в апоптотических клетках,
3) активирование разных путей передачи сигнала для апоптоза.
При апоптозе изменяются мембраны, в частности, гликопротеины и гликолипиды теряют сиаловую кислоту , а на клеточной поверхности увеличивается количество рецептора витронектина и, как указывалось выше, фосфатидилсерина — факторов, привлекающих макрофаги.
При апоптозе активируются разные изоформы фосфолипазы с, затем образуются вторичные мессенджеры диацилглицерин (DAG) и инозит-1,4,5-трифосфат (IP3). DAG активирует семейство сериновых и треониновых киназ (протеинкиназа с), a IP3 стимулирует освобождение Са 2 + из внутриклеточных депо в цитозоль. Вызывать апоптоз могут также тирозинкиназы и некоторые токсины , нарушающие гомеостаз Са .
Предложена гипотеза о существовании генетической программы самоуничтожения митохондрий, клетки, органа, организма, соответственно — митоптоз, апоптоз, органоптоз, феноптоз . Эта программа названа «самурайским законом биологии» (В.П. Скулачев, 1996). При апоптозе в клетке образуется специфический «белок самоубийства» р53 , который способствует реализации этой программы. Активация этого белка некоторыми интерферонами даёт эффект при лечении рака . В настоящее время проблему апоптоза исследуют весьма активно, так как она связана с решением проблемы старения. Если бы удалось регулировать апоптоз, можно было бы замедлить старение человека.
Исходя из гипотезы, что запуск программы самоуничтожения начинается вследствие снижения активности антиокислительной системы (АО С) в митохондриях и накопления в них активных форм кислорода (АФК), был предложен путь борьбы с этим явлением путем внедрения в органеллы клеток веществ с антиокислительными свойствами.
Однако действие известных естественных антиокислителей, в частности, витаминов С и Е, к успеху не приводило. Поэтому синтезировали вещества со свойствами АОС. После многочисленных испытаний оказалось, что оптимальным для этой цели являются фенилфосфониевые катионы (ФФК). Из них было синтезировано вещество, названное «ионом Скулачева» (SkQ). Он представляет собой комплексное соединение тетрафенилфосфониевого катиона , где ионом-комплексообразователем является Р(III) (рис. 2). Такая структура имеет делокализованный положительный заряд.
Рис. 2. Ион Скулачева — трифенилфосфин, связанный деканом с пластохиноном.
Видно, что SkQ алкилирован деканом C 10 H 22 образованием поляризованной молекулы с положительно заряженной головкой иона и липофильным хвостом. Этот комплекс легко проникает в клетку через отрицательно заряженную плазматическую мембрану в цитоплазму и через еще более отрицательно заряженную митохондриальную мембрану в матрикс органеллы и накапливается там, предположительно, в результате простого взаимного притяжения разноименных зарядов по физическим законам. Пластохинон, по мнению авторов, увеличивает антиоксидантную активность иона.
Точечное воздействие даже при наноконцентрациях позволяет этому комплексу длительно находиться внутри митохондрий (до 4-суток). Ферменты, находясь в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), не могут разрушить этот комплекс внутри митохондрий, поскольку неспособны преодолеть мембранный барьер.
Скулачев полагает, что антиокислительные свойства иона SkQ, позволяют нейтрализовать свободные радикалы внутри митохондрий и тем самым оказывают положительное фармакологическое действие, активируя АО С. Однако такое объяснение совсем не учитывает твердо установленное влияние на процессы апоптоза ионов металлов, в частности, Са 2 + и Zn 2 + , и законы межэлементных взаимодействий, в частности, их антагонизм.
С точки зрения бионеорганики механизм процессов апоптоза и влияния на них фенилфосфониевых катионов более сложен. В соответствие со следствием закона замещения , «свободный» Са вытесняет ионы переходных металлов из комплексов с белками и нуклеопротеинами, нарушая их функционирование и вызывая полимикроэлементоз . Избыток Са 2 + вытесняет Mg 2 + , инактивируя все обменные процессы, связанные с АТФ. В первую очередь это проявляется в снижении активности натриевого насоса и, следовательно, мембранного потенциала (Ψ) и зависящих от него процессов нейтрализации свободных радикалов. Из-за вытеснения из ферментов АОС ионов металлов-комплексообразователей (Fe, Си, Se, Zn ) активность этих ферментов по определению снижается.
Поскольку основные ферменты АОС (каталаза, пероксидаза, цитохромоксидаза, глутатионпероксидаза) содержат гемин с Fe, Си , а селенопротеины — Se и I , избыток Са 2 + в цитоплазме автоматически приводит к резкому снижению антиокислительной активности без участия каких-либо генов. При преодолении фракционного порога начинается цепная реакция , то есть в каждом атоме с неспаренным электроном появляется свободный радикал. Запускается цепь превращений уже существующих валентнонасыщенных исходных молекул в более реакционноспособные продукты. Причем процессы апоптоза начинаются с нарушения деятельности мембран, вероятно, каким-то образом связанного с синтезом коллагена.
«Свободный» Са 2 + играет на начальных стадиях развития апоптоза ключевую роль, поскольку является инициатором цепной реакции. Его концентрация при апоптозе в клетках всегда увеличивается. «Свободный» Са цитотоксичен, он нарушает многие процессы метаболизма. В частности, в результате активируются эндонуклеаза , расщепляющая ДНК во внутренних участках нуклеосом, и тканевая трансглутаминаза , ковалентно связывающая белки с мембраной изопептидными связями. Понятно, что при этом нарушается функционирование и нуклеопротеинов, и мембран.
Zn 2 + , в соответствии с законом замещения , будучи ионом непереходного металла 4 периода, образующим комплексы с биолигандами с наибольшими К уст, способен снижать концентрацию Са в клетках и, следовательно, отдалять начало апоптоза. Поэтому его считают ингибитором этого процесса, подавляющим, в частности, активность эндонуклеазы и трансглутаминазы. Отмеченное всеми исследователями апоптоза замедление процесса гибели клеток при поступлении в них Zn 2 + объясняется тем, что содержание «свободного» Са 2 + в цитоплазме клеток уменьшается, а активность АОС возрастает. Поэтому можно полагать, что любое воздействие, снижающее фракцию «свободного» Са 2 + в клетке и её органеллах, будет замедлять процессы старения и оказывать положительный фармакологический эффект при заболеваниях, сопровождаемых накоплением этой фракции. Среди таких заболеваний можно назвать болезни глаз, остеопороз, прогерию и болезнь Дауна .
Механизм цепной реакции , как и его особенности, хорошо известны на примере атомной бомбы. Характерным свойством этой реакции является её многостадийностъ . Среди важнейших стадий — зарождение цепи (инициирование ), продолжение цепи (зарождение новых активных частиц = радикалов), обрыв цепи («гибель » активных частиц). Сами цепи могут быть неразветвленными , когда на каждую израсходованную активную частицу приходится одна вновь образованная, или разветвленными , когда на одну израсходованную активную частицу приходится две и более вновь образованных.
Разветвленные цепные реакции могут происходить в стационарном режиме, когда скорость разветвления меньше скорости гибели активных частиц, и в нестационарном , когда гибель происходит медленнее, чем разветвление. В этом случае скорость реакции возрастает по экспоненте и лимитируется только расходованием исходных веществ. Причем переход от стационарного к нестационарному режиму происходит скачкообразно при очень небольшом изменении концентрации одного из исходных веществ — наблюдается цепной «взрыв».
Цепные реакции отличаются очень эффективным изменением их свойств, и даже направленности, при наличии ничтожных примесей веществ, способных выводить из системы активные частицы, то есть ингибиторов , или, напротив, облегчать их формирование — инициаторов . Именно по такому механизму, многостадийно и очень медленно на первых стадиях, развивается процесс апоптоза. Следовательно, при рассмотрении этой проблемы надо исходить из общих закономерностей, а не частных, связанных с «генами смерти» или «борьбой» со свободными радикалами. Именно по этой причине антиокислительные витамины Е и С не оказывают существенного воздействия на процессы апоптоза, так как воздействуют не на причину цепной реакции, а на её следствие.
Р (III) в SkQ, являясь комплексообразователем, не способен многократно изменять свою валентность — что совершенно необходимо для процесса переноса электронов, происходящего в АОС. В то же время известно, что P (V), образуемый при окислении Р (III), является компонентом кислородных кислот, в частности фосфорной кислоты, которая легко связывается с Са 2 + , образуя трифосфат Ca 3 (P 3 O 10) 2 . Анион с пятивалентным фосфором в этом соединении является секвестрирующим агентом , а образовавшаяся соль устойчива, что выводит Са 2 + из «свободной» фракции.
С точки зрения бионеорганики фенилфосфониевые катионы, в случае их попадания внутрь клеток и митохондрий, служат эффективным источником активного фосфора для нейтрализации избытка «свободного» Са 2 + . То есть они, как и Zn 2 + , оказываются ингибитором цепной реакции апоптоза, но с иным механизмом действия.
Описанным механизмом апоптоза объясняется, в частности, факт продления жизни атлантического лосося при заражении жабр личинками двустворчатого моллюска жемчужницы Margarititera margarititera . Эти личинки усиленно поглощают «свободный» Са 2 + для построения своей раковины, то есть в данном случае оказываются секвестрирующим агентом в цепной реакции начавшегося полимикроэлементоза, блокируя эту реакцию.
Альбатрос живет около 50 лет, и в течение его жизни признаков старения, в том числе репродуктивной функции, не появляется, после чего птица неожиданно умирает от спонтанного «взрывного» ускорения процессов апоптоза. Это объясняется тем, что согласно правилу фракционного порога , в некоторый момент возрастающая концентрация «свободного» Са 2+ преодолевает такой порог, наступает нестационарная стадия цепной реакции, приводящая к быстрому финалу — смерти организма.
Опыты на животных (лабораторных грызунах, кроликах, собаках, кошках, лошадях) с дистрофией сетчатки и катарактой, которым закапывали в глаза 20 нМ раствор SkQ, показали, что после нескольких недель лечения болезни глаз излечивались, причем прозревали даже некоторые слепые животные. Получены положительные предварительные данные об использовании SkQ для лечения 12 различных старческих заболеваний, в частности, остеопороза, инфарктов и болезней глаз — глаукомы и катаракты . Предполагаемый механизм развития апоптоза показан на рис. 3.
Рис. 3. Предполагаемый механизм развития апоптоза
Проблема рака противоположна проблеме апоптоза. В отличие от старения, когда нужно замедлить процесс апоптоза, при раке нужно сделать прямо противоположное - ускорить этот процесс в раковых клетках. Наиболее эффективны для этого могут быть меры, увеличивающие содержание «свободной» фракции Са в цитозоле клеток и в митохондриях выше фракционного порога, после которого начинается цепная реакция апоптоза в виде гибели раковых клеток. Исходя из особенностей механизмов цепной реакции, подобный эффект должен проявляться уже при наноконцентрациях действующих веществ.
Что касается теории об апоптозе, как генетически запрограммированной смерти, не менее вероятной представляется гипотеза о цепной реакции нарушения металл-лигандного гомеостаза. Цепные реакции отражают более фундаментальные природные процессы, чем сопутствующие им генетически закреплённые биологические проявления. Поэтому гипотезу о природе апоптоза, как проявлении цепной реакции микроэлементоза кальция, переходящего в полимикроэлементоз, нельзя отбросить без объяснения роли металлов в этом процессе с точки зрения общераспространённой теории.
Известно, что запись кода не всегда соответствует «центральной догме» биологии (ДНК > РНК > белок). Открытие отмеченных Нобелевскими премиями обратных ревертаз, в том числе теломераз (2009 г.), а также прионов (Prusiner, 1997), подтверждает правомерность такой точки зрения. Активация «спящих генов» вызывается тем или иным состоянием металл-лигандного гомеостаза. Например, соотношение металлов, связанных с нарушением обмена Си , «будит» или ген синтеза белков болезни Вильсона, которая в настоящее время излечима, или ген синтеза белков болезни Менкеса, которая пока неизлечима. При этом «разбуженный» ген полностью подавляет другой (Bertini, 2008).
Медицинская бионеорганика. Г.К. Барашков
Или уклонение от программированной клеточной смерти опухолевых клеток - важнейшее свойство злокачественного фенотипа.
В норме апоптозная программа присутствует в латентной форме во всех клетках организма, поскольку вполне очевидно, что в организме под влиянием различных факторов при прохождении клеткой клеточного цикла постоянно происходят повреждения ДНК, т.е. возникают мутации.
Известно, что в течение жизни в организме человека происходит 10 16 клеточных делений. Спонтанные мутации происходят с частотой - 10 6 на ген за клеточный цикл.
Таким образом, в течение жизни человека каждый ген вполне может подвергнуться мутированию около 10 миллиардов раз (10 16 х10 6 = 10 10), а ежедневно в организме происходит до 1 млн соматических мутаций.
И среди них, несомненно, возможны, ведущие к раку. С этих позиций проблема рака не столько в том, почему он возникает, а в том, почему он возникает так редко.
А возникает рак, несмотря на постоянное воздействие канцерогенных факторов, относительно редко потому, что в организме существуют механизмы защиты, направленные на сохранение нормального генотипа клетки. Необходимо отметить, что судьба клеток с теми или иными генетическими повреждениями может быть различной.
Часть мутированных клеток гибнет из-за витальных повреждений их генома, часть восстанавливается, часть организм уничтожает сам посредством апоптоза и, наконец, часть мутированных клеток выживет и в процессе размножения может стать источником накопления потенциально онкогенных мутаций и развития рака.
В норме генетический фонд клетки, несмотря на его хрупкость, защищен мощным ферментным аппаратом, часто обеспечивающим распознавании мутированных и измененных участков ДНК и их восстановление.
Репарация ДНК заключается в «вырезании» мутированных нуклеотидов с помощью эндо- и экзонуклеаз, синтеза нормального участка ДНК при участии ДНК-полимеразы и встраивании восстановленного участка в цепь ДНК под действием фермента лигазы. Тем самым воссоздается исходная генетически запрограммированная нуклеотидная последовательность поврежденной нити (рис. 3.12).
Рис 3.12. Схема репарации при повреждении ДНК и формирование мутации [Новик А.Л., 2004].
Если же активность репарационно-восстановительных систем недостаточна и повреждения в ДНК сохраняются, то в таких клетках индуцируется программируемая клеточная гибель, что приводит к уничтожению, в том числе и мутантных клеток, способных к злокачественной трансформации.
Апоптоз (от греч. apoptosis - опадание) - запрограммированная гибель клетки или «смерть клетки в результате самоуничтожения» - активный, генетически контролируемый процесс. Термин был предложен Kerr J. и соавт. (1972) для обозначения происходящих изменений в клетке во время ее физиологической гибели и ведущих к уменьшению числа клеток в противоположность митозу, обеспечивающему увеличение их числа.
Биологическое значение апоптоза
Биологическое значение апоптоза состоит в том, что это ключевой механизм поддержки генетического гомеостаза, который организм использует для удаления клеток, чье выживание нежелательно: чужеродных, дефектных с поломками в геноме; мутантных или зараженных вирусом; с неадекватной специфичностью рецепторов к различным регуляторам жизнедеятельности и т.д.В организме в каждую единицу времени миллионы клеток завершают свой цикл, отрабатывают «свой век». Для предотвращения «засорения» организма от успевших выполнить свою функцию «отработанных», «изношенных» клеток в ходе эволюции выработался специальный механизм их ликвидации - апоптоз.
Способность запускать самоликвидацию (апоптоз), является неотъемлемым свойством клеток для поддержания тканевого гомеостаза путем сохранения определенного баланса между пролиферацией (митозом) и гибелью.
Апоптоз играет исключительно важную роль в эмбриогенезе, в частности в регуляции количества мезодермальной ткани при формировании органов и скелета. В основе уничтожения иммунными клетками чужеродных также лежит апоптотический механизм.
Гибель клеток по типу апоптоза происходит при многих физиологических процессах: возрастной инволюции органов (тимус), атрофии (предстательной железы после кастрации), регрессии гиперплазии нормапьном функционировании яичников и семенников и, наконец, в уничтожении мутантных клеток.
Механизм активации апоптоза
Зрелые дифференцированные клетки в обычном состоянии устойчивы к индукции апоптоза, но становятся чувствительными к нему после своей активации. Такую активацию вызывают различные внешние воздействия через специфические рецепторы и внутриклеточные сигналы, вызванные экспрессией некоторых протоонкогенов.Они могут быть физиологическими - активация специальных киллерных цитокинов, изменения гормонального статуса (цикличное изменение эндометрия и др.), и нефизиологическими - внутриклеточные повреждения или неблагоприятные условия (нехватка факторов роста, повреждения ДНК, гипоксия и т.д.).
В механизмах активации апоптоза выделяют два основных этапа: фазу индукции (принятия решения) и фазу экзекуции (исполнения приговора). В первую фазу система сенсоров апоптоза отслеживает отклонения от нормы внутри- и внеклеточной среды и определяет дальнейшую судьбу клетки: жить ей или умереть.
Класс сенсоров представляет собой рецепторы клеточной поверхности, которые связывают сигналы выживания или смерти. В качестве таких сигналов выступают различные, цитокины.
При выявлении аномалий (например, повреждение ДНК, нехватка факторов роста, гипоксия и др.) посредством сенсорных регуляторов запускается вторая фаза апоптоза - исполнения приговора. Начинается она с активации каспаз + ферментов семейства цистеиновых протеиназ (так называемые казнящие каспазы).
Существует два принципиально разных пути активации каспаз. Один из них запускается в ответ на активный сигнал смерти, передаваемый специфическими киллерными цитокинами группы ФНО (фактор некроза опухолей) на соответствующие рецепторы (наиболее изучены Fas), называемые рецепторами смерти.
Апоптоз, вызванный активированными рецепторами смерти, называется инструктивным апоптозом. При втором пути активации каспаз ключевую роль играют митохондрии - митохондриальный апоптоз.
При этом различные повреждающие воздействия вызывают увеличение проницаемости мембраны митохондрий и выход в цитоплазму митохондриальны белков (в основном цитохрома С), которые через соответствующий каскад реакций и активируют каспазы.
Ключевую роль в регуляции проницаемости митохондриальной мембраны для цитохрома С играют белки семейства bcl-2, обладающие либо проапоптотическими, либо антиапоптотическими активностями.
Таким образом, в клетках человека в ответ на повреждения существует два механизма, запускающих апоптоз: инструктивный, вызываемый рецепторами смерти, и митохондриальный, обусловленный повышенной проницаемостью мембран. Между ними существует взаиморегуляция, что позволяет надежнее достигать конечного эффекта.
В итоге активированные тем или иным путем каспазы протеолитически расщепляют ключевые структурные компоненты клетки, что приводит к фрагментации ДНК и деструкции клетки. При этом цитоппазматический и ядерный скелеты разрушаются, хромосомы деградируют, ядро фрагментируется, но без разрыва клеточной мембраны.
Поэтому такая клетка может быть утилизирована фагоцитами и соседними клетками, и даже массовая их гибель не приводит к каким-либо патологическим процессам. Процесс протеолиза продолжается 30-120 минут, затем сморщенная клетка поглощается макрофагами и исчезает обычно в течение 24 часов (рис. 3.13).
Рис. 3.13. Фагоцитоз апоптотической клетки макрофагом [Фильченков А.А., Стойка Р.С., 1999]. 1 - фрагментированное ядро; 2 - фрагменты цитоплазмы (апоптотические тельца): 3 - фрагменты апоптотической клетки захвачены макрофагом.
Задачей апоптоза является утилизация фрагментов клетки пока ее содержимое не попало во внеклеточную среду и не вызвало воспалительного процесса. Внешние морфологические проявления апоптотической гибели клеток в виде кариопикноза (сморщивание ядра), кариорексиса (распад ядра на части), конденсации (сжатия) клетки и др. были известны давно и только в последнее время показано, что это частные проявления апоптоза. Вокруг клеток, подвергшихся апоптозу, воспалительный процесс не возникает.
Гибель клеток по типу апоптоза следует отличать от некроза - другой формы гибели клеток организма. Некроз инициируется нефизиологическими агентами, а апоптоз - и физиологическими, и нефизиологическими. В отличие от некроза, апоптоз встречается не только в патологически измененных, но и нормальных тканях.
Некроз происходит в случае, когда клетки подвергаются действию экстремальных факторов и поэтому его можно назвать патологической гибелью. При некрозе морфологические изменения как реакция на летальное повреждение клетки, почти всегда начинается с повреждения плазматической мембраны, что не бывает при апоптозе.
Из-за разрыва мембраны в клетку из внеклеточного пространства поступают молекулы воды и ионов и вызывают набухание структур. Одновременно попадание содержимого цитоплазмы (в том числе лизосомальных ферментов) во внеклеточное пространство вызывает повреждения тканей и развитие выраженного воспалительного процесса, что не происходит при апоптозе.
Кроме того, при апоптозе отмирают одиночные клетки, а при некрозе - их группы. Уничтожение клеток путем апоптоза по сравнению с некрозом обеспечивает минимальное повреждение тканей. Между этими процессами имеются и другие различия. На рисунке 3.14 схематически представлены две формы гибели клеток.
Рис. 3.14. Схематическое представление о двух формах гибели клеток [по Wyllle А. и соавт., 1998].
Как и другие физиологические процессы, апоптоз регулируется большим числом генов. Ключевая роль в запуске программы апоптоза принадлежит гену-cупpeccopy р53. Вследствие особой значимости р53 был назван геном XX века. р53 поддерживает стабильность генетического аппарата и осуществляет контроль над клеточным циклом.
В норме, при повреждениях структуры ДНК или других формах генотоксического стресса отмечается быстрая активация р53. Его белок блокирует клеточный цикл в фазе G1 до удвоения ДНК и митоза, инициирует и участвует в процессах репарации ДНК. Это позволяет клетке восстанавливать поврежденный участок ДНК, что предотвращает появление мутантных клеток.
При тяжелых неустранимых повреждениях р53 запускает программу апоптоза и тем самым предупреждает патологическую пролиферацию. Важно подчеркнуть, что р53-зависимый апоптоз элиминирует из организма не только поврежденные, но и те клетки, в которых наблюдается нерегулируемая стимуляция пролиферации.
Если р53 мутирует, он инактивируется и перестает запускать апоптозный каскад, что дает возможность сохраняться клеткам с поврежденной ДНК во время митоза, а это в свою очередь приводит к выживанию клеток, подвергшихся опухолевой трансформации (рис 3.15).
Рис. 3.15. Регулирующее влияние антионкогена р53 . Повреждение гена создает условия для патологической клеточной пролиферации.
Предполагается, что увеличение частоты неоплазии с возрастом связано не с накоплением мутаций в геноме клеток, а с возрастными нарушениями системы репарации ДНК.
Естественно, апоптоз рассматривается как мощная противоопухолевая защита. Угнетение процесса резко облегчает превращение нормальной клетки в раковую, так как в неспособных к апоптозу клетках легко будут накапливаться различные мутации.
Такие клетки-мутанты, несмотря на повреждения ДНК, будут продолжать активно размножаться. Накопление критического количества мутаций неизбежно приведет к появлению неоппастической клетки и формированию злокачественной опухоли (рис. 3.16).
Рис. 3.16. Нарушение процессов пролиферации (П) и апоптоза (А) клеток при онкогенезе [Фильченков А.А., Стойка Р.С., 1999].
Приобретенная резистентность к апоптозу является признаком большинства, если не всех опухолевых клонов. Уход от апоптоза резко повышает жизнеспособность неопластической клетки, делает ее менее чувствительной к факторам противоопухолевого иммунитета и терапевтическим воздействиям. Опухолевые клетки приобретают резистентность к апоптозу различными путями.
На сегодня установлено, что к ослаблению индукции апоптоза могут привести потеря экспрессии на поверхности клетки рецептора смерти Fas; нарушения проведения апоптогенного сигнала к митохондриям и ингибирование проницаемости митохондриальной мембраны для цитохрома С; блокирование активации и/или резкое уменьшение времени жизни казнящих каспаз.
Очевидно, наряду с белками, включающими апоптоз, есть белки, препятствующие ему, и между теми и другими существует тонкий баланс. Гены, способствующие апоптозу, относятся к генам-супрессорам (кроме р53, ВАХ, PML и др.). Гены, блокирующие работу этого защитного механизма - к протоонкогенам (BCL1, BCL2 и др.).
Последние при их активации нейтрализуют апоптозную активность и будут резко увеличивать появление постоянно пролиферирующих мутантных клеточных клонов, а, следовательно, и вероятность последующего развития из них злокачественных опухолей.
Считается, что соотношение количества различных форм онкобелков группы BCL и р53 определяет реостат жизни и смерти клетки. В связи с этим следует заметить, что вследствие существования механизма апоптоза принципиально невозможно достигнуть бессмертия организма.
С течением времени наступает атрофия клеток органов, регуляторов жизнедеятельности организма и развивается ряд заболеваний, которые объединяют общим названием -
Апоптоз
Смерть клеток в организме может происходит 2 путями: некроза и апоптоза .
Апоптоз – это такой тип гибели клеток, при котором сама клетка активно участвует в процессе своей гибели, т.е. происходит самоуничтожение клетки. Апоптоз, в отличие от некроза, является процессом активным, после воздействия этиологических факторов запускается генетически запрограммированный каскад реакций, сопровождающийся активацией определенных генов, синтезом белков, ферментов, приводящих к эффективному и быстрому удалению клетки из ткани.
Причины апоптоза.
1. Во время эмбриогенеза апоптоз играет важную роль в разрушении различных тканевых зачатков и формировании органов.
2. Апоптозу подвергаются стареющие клетки, закончившие цикл своего развития, например, исчерпавшие запас цитокинов лимфоциты.
3. В растущих тканях определенная часть дочерних клеток подвергается апоптозу. Процент погибающих клеток может регулироваться системными и местными гормонами.
4. Причиной апоптоза может быть слабое воздействие повреждающих факторов, которые при большей интенсивности могут привести к некрозу (гипоксия, ионизирующее излучение, токсины и др.)
Патогенез апоптоза:
Клетка подвергается апоптозу, если в ядре происходит повреждение ДНК, которое не может быть исправлено системой репарации. За данным процессом следит белок, кодируемый геном р53. При невозможности устранения дефекта ДНК под действием р53-протеина активируется программа апоптоза.
На многих клетках имеются рецепторы, воздействие на которые вызывает активацию апоптоза. Наиболее изученными являются Fas-рецептор, обнаруженный на лимфоцитах, и рецептор к фактору некроза опухолей-альфа (TNF-α), обнаруженный на многих клетках. Данные рецепторы играют большую роль в удалении аутореактивных лимфоцитов и регуляции постоянства размера клеточной популяции по типу обратной связи.
Активировать апоптоз могут различные метаболиты и гормоны: противовоспалительные цитокины, стероидные гормоны, окись азота (NO) и свободные радикалы.
Апоптоз клеток активируется при недостатке кислорода в тканях. Причиной его активации может быть действие свободных радикалов, нарушение энергетически зависимых процессов репарации ДНК и др.
Апоптозу подвергаются клетки, утратившие связь с межклеточным матриксом, базальной мембраной или соседними клетками. Утрата данного механизма апоптоза в опухолевых клетках приводит к появлению способности метастазировать.
Некоторые вирусные белки могут активировать апоптоз клеток после самосборки вируса в зараженной клетке. Поглощение апоптотических телец соседними клетками ведет к их заражению вирусом. Вирус СПИДа также может активировать апоптоз незараженных клеток, имеющих на своей поверхности CD4-рецептор.
Также существуют факторы, препятствующие апоптозу. Замедлять апоптоз могут многие метаболиты и гормоны, например, половые гормоны, провоспалительные цитокины. Апоптоз может резко замедляться при дефектах в механизме гибели клетки, например, при мутации в гене р53 или активации генов, тормозящих апоптоз (bcl-2). Многие вирусы обладают способностью ингибировать апоптоз после встраивания собственной ДНК в геном клетки на период синтеза собственных структурных белков.
Морфологические проявления апоптоза
Апоптоз имеет свои отличительные морфологические признаки, как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровне. Наиболее четко морфологические признаки выявляются при электронной микроскопии. Для клетки, подвергающейся апоптозу характерно:
Сжатие клетки. Клетка уменьшается в размерах; цитоплазма уплотняется; органеллы, которые выглядят относительно нормальными, располагаются более компактно. Предполагается, что нарушение формы и объема клетки происходит в результате активации в апоптотических клетках трансглютаминазы и цистеиновых протеаз (каспаз). Первая группа ферментов вызывает образование перекрестных связей в цитоплазматических белках, что приводит к формированию своеобразной оболочки под клеточной мембраной, подобно ороговевающим клеткам эпителия, а вторая группа ферментов разрушает белки в цитозоле.
Конденсация хроматина. Это наиболее характерное проявление апоптоза. ДНК расщепляется эндонуклеазами в местах, связывающих отдельные нуклеосомы, что приводит к образованию большого количества фрагментов, в которых число пар оснований делится на 180-200, которые затем конденсируются под ядерной мембраной. Ядро может разрываться на два или несколько фрагментов.
Формирование апоптотических телец. В апоптотической клетке формируются глубокие впячивания клеточной мембраны, что приводит к отшнуровке фрагментов клетки, т.е. формированию окруженных мембраной апоптотических телец, состоящих из цитоплазмы и плотно расположенных органелл, с или без фрагментов ядра.
Фагоцитоз апоптотических клеток или телец осуществляется окружающими здоровыми клетками, как макрофагами, так и паренхиматозными. Апоптотические тельца быстро разрушаются в лизосомах, а окружающие клетки либо мигрируют, либо делятся, чтобы заполнить освободившееся после гибели клетки пространство.
При окраске гематоксилином и эозином апоптоз определяется в единичных клетках или небольших группах клеток. Апоптотические клетки имеют округлую или овальную форму, интенсивно эозинофильную цитоплазму с плотными фрагментами ядерного хроматина. Поскольку сжатие клетки и формирование апоптотических телец происходит быстро и также быстро они фагоцитируются, распадаются или выбрасываются в просвет органа, то на гистологических препаратах апоптоз обнаруживается в случаях его значительной выраженности. К тому же апоптоз – в отличие от некроза – никогда не сопровождается воспалительной реакцией, что также затрудняет его гистологическое выявление.
Для выявления клеток, находящихся на ранних этапах апоптоза, используют специальные иммуногистохимические исследования, например, определение активированных каспаз или TUNEL-метод, визуализирующий разорванную эндонуклеазами ДНК.
Значение апоптоза.
1. Апоптоз имеет огромное значение в эмбриогенезе (включая имплантацию и органогенез). Нарушение гибели клеток в межпальцевых промежутках может привести в синдактилии, а отсутствие апоптоза избыточного эпителия при слиянии небных отростков или тканей, окружающих нервную трубку, приводит к нарушению слияния тканей с двух сторон, что проявляется расщеплением твердого неба и дефектом в тканях, ограничивающих спинномозговой канал, (spina bifida), соответственно.
2. Апоптоз играет важную роль в поддержании постоянства клеточного состава, особенно в гормон-чувствительных тканях. Замедление апоптоза приводит к гиперплазии тканей, ускорение – к атрофии. Он принимает участие в отторжении эндометрия во время менструального цикла, атрезии фолликулов в яичниках в менопаузе и регрессии ткани молочной железы после прекращения лактации.
3. В данный момент исследуется огромное количество лекарственных препаратов, направленных на регуляцию апоптоза в определенных тканях. Так, ускорение апоптоза иммунокомпетентных клеток можно использовать для лечения аутоиммунных заболеваний и предотвращения отторжения трансплантата, замедление апоптоза может использоваться для предотвращения апоптоза в тканях, испытывающих ишемию, повышенное внешнее давление или временно бездействующих тканях. Замедление апоптоза при вирусных инфекциях предотвращает распространение инфекции на соседние клетки.
4. Во всех опухолях наблюдается нарушение апоптоза в опухолевых клетках. Эта поломка может происходить на разных этапах апоптоза, например, может происходить мутация гена р53, что приведен к тому, что мутантный протеин-р53 будет накапливаться в клетке в избыточном количестве, но не будет вызывать апоптоз несмотря на дефекты в геноме клетки, что приведет к пролиферации клеток с нарушенным геномом, причем с каждым последующим делением нарушения в ДНК будут накапливаться. Иногда в опухолевых клетках может накапливаться и нормальный, или «дикий», протеин р53, если поломка в механизме апоптоза происходит на других уровнях. При хронических лимфоидных лейкемиях наблюдается накопление продуктов гена bcl-2, что приводит к патологическому удлинению срока жизни опухолевых клеток и резистентности клеток к различным проапоптотическим факторам. Иногда нарушается передача сигналов от рецепторов гибели клеток, например, с рецептора к TNF-α. TNF-α принимает участие в регуляции клеточной популяции по типу обратной связи. Все клетки в популяции выделяют TNF-α в небольших количествах; чем больше клеток в ткани, тем выше концентрация TNF-α, а значит и уровень апоптоза. Таким образом достигается баланс между пролиферацией и гибелью клеток. Опухолевые клетки теряют способность подвергаться апоптозу под действием этого цитокина, при этом он накапливается в большом количестве в опухолевой ткани. В результате этого TNF-α начинает в большом количестве попадать в кровоток и вызывать апоптоз паренхиматозных клеток во многих органах, приводя к кахексии.
При реализации апоптоза условно можно выделить четыре стадии.
Инициация -> Программирование -> Реализация программы -> Удаление погибшей клетки
Стадии апоптоза Стадия инициации
На этой стадии информационные сигналы рецептируются клеткой . Патогенный агент либо сам является сигналом, либо обусловливает генерацию сигнала в клетке и его проведение к внутриклеточным регулятор-ным структурам и молекулам.
Инициирующие апоптоз стимулы могут быть трансмембранными или внутриклеточными.
Трансмембранные сигналы подразделяют на отрицательные, положительные и смешанные.
- Отрицательные сигналы : отсутствие или прекращение воздействия на клетку факторов роста, цитокинов, регулирующих деление и созревание клетки, а также гормонов, контролирующих развитие клеток. В норме действие названных выше групп БАВ на мембранные рецепторы обеспечивает подавление программы гибели клеток и нормальную их жизнедеятельность. Напротив, их отсутствие или снижение эффектов «освобождает» программу апоптоза. Так, для нормальной жизнедеятельности ряда нейронов необходимо постоянное наличие нейротрофических факторов. Их устранение или снижение эффектов на нервные клетки может привести к включению программы смерти нейрона. - Положительные сигналы в итоге генерируют запуск программы апоптоза . Так, связывание ФИО (FasL) с его мембранным рецептором CD95 (Fas) активирует программу смерти клетки. - Смешанные сигналы являются комбинацией воздействий сигналов первой и второй групп. Так, апоптозу подвергаются лимфоциты, простимулированные митогеном, но не проконтактировавшие с чужеродным Аг. Погибают и те лимфоциты, на которые воздействовал Аг, но не получившие других сигналов, например митогенного или от HLA.
Среди внутриклеточных стимулов апоптоза зарегистрированы избыток Н+, свободные радикалы липидов и других веществ, повышенная температура, внутриклеточные вирусы и гормоны, реализующие свой эффект через ядерные рецепторы (например, глюкокортикоиды).
Апоптоз: стадия инициации.
Стадия программирования
Стадия программирования (контроля и интеграции процессов апоптоза) представлена на рисунке.
На этой стадии специализированные белки либо реализуют сигнал к апоптозу путём активации исполнительной программы (её эффекторами являются цистеиновые протеазы - каспазы и эндонуклеазы), либо блокируют потенциально летальный сигнал.
Выделяют два (не исключающих друг друга) варианта реализации стадий программирования : 1) путём прямой активации эффекторных каспаз и эндонуклеаз (минуя геном клетки) и 2) опосредованной через геном передачи сигнала на эффекторные каспазы и эндонуклеазы.
Прямая передача сигнала осуществляется через адапторные белки, гранзимы и цитохром С.
Адапторные белки . В качестве адапторного белка выступает, например, каспаза-8. Так реализуют своё действие цитокины Т-лимфоцитов-киллеров в отношении чужеродных клеток, ФНО и другие лиганды CD95.
Цитохром С . Выделяясь из митохондрий, цитохром С вместе с белком Apaf-1 и каспазой-9 формирует комплекс активации (апоптосому) эффекторных каспаз. Каспаза-8 и каспаза-9 активируют эффекторные каспазы (например, каспазу-3), которые участвуют в протеолизе белков.
Гранзимы . Эти протеазы выделяют цитотоксические Т-лимфоциты, протеазы проникают в клетки-мишени через цитоплазматические поры, предварительно сформированные перфоринами. Гранзимы активируют аспартатспецифи-ческие цистеиновые протеазы клетки-мишени, подвергающейся апоптозу.
Прямая передача сигнала наблюдается обычно в безъядерных клетках, например в эритроцитах.
Апоптоз: стадия программирования.
Опосредованная передача сигнала подразумевает репрессию генов, кодирующих ингибиторы апоптоза, и активацию генов, кодирующих промоторы апоптоза.
Белки-ингибиторы апоптоза (например, продукты экспрессии антиапоптозных генов Bcl-2, Bcl-XL) блокируют апоптоз (например, путём уменьшения проницаемости мембран митохондрий, тем самым уменьшая вероятность выхода в цитозоль одного из пусковых факторов апоптоза - цитохрома С).
Белки-промоторы апоптоза (например, белки, синтез которых контролируется генами Bad, Box, антионкогенами Rb или /т53) активируют эффекторные кас-пазы и эндонуклеазы.
В процессе появления многоклеточных живых организмов понадобились механизмы регуляции правильного роста и развития, одним из таких регуляторов является апоптоз.
Апоптоз – это форма запрограммированной гибели клетки, которая проявляется в уменьшении размера клетки, фрагментации и конденсации хроматина, уплотнении мембран (наружной и цитоплазматической) без вытекания содержимого клетки в окружающую ее среду.
Процесс является двухфазным:
1. Первая фаза получила название латентной и основана на проведении сигналов апоптоза. Другими словами - «фаза решения проблем». В зависимости от характера действия раздражителей ее можно разделить на 2 типа:
а) повреждение ДНК посредством воздействий токсинов, радиации и других факторов;
б) активация рецепторов "регион клеточной смерти" (РКС).
«Регион клеточной смерти» - это рецепторы на мембранах всех клеток, которые воспринимают стимулы для активации апоптоза. Если количество активированных рецепторов увеличивается, то возрастает и количество физиологически гибнущих клеток. К наиболее изученным РКС относят CD95 (Fas, Apo1), TNFR1 (p55, CD120a), а также CAR1, D3, DR4, DR5 и др. Этот процесс не сопровождается повреждением ДНК.
2. Вторая фаза получила название «эффекторная», потому что в ней происходит разрушение клеточных ультраструктур. Основными исполнителями эффекторной фазы являются эндонуклеазы, цистеиновые протеазы (каспазы), лизосомальные и сериновые протеазы .
Farber E. (1994) предложил классификацию запрограммированной клеточной гибели (ЗКГ):
Запрограммированная онтогенетическая гибель клеток - это гибель, которая происходит в ходе нормального развития и/или метаморфоза клеток.
Запрограммированная физиологическая гибель дифференцированных клеток зрелых организмов в ходе деструкции гиперплазированных тканей в результате экзогенных и эндогенных повреждений органов и тканей. Она проявляет себя тогда, когда необходимо восстановление клеточного состава.
Запрограммированная биохимическая клеточная гибель после действия патоагентов разного происхождения. Этот тип смерти не физиологический, так как он представляет собой ответную реакцию организма (активную или пассивную) на повреждающий агент.
В основе всех форм ЗКГ лежит генетически определенная программа клеточной гибели. Это подтверждается участием многих генов в основе этой программы на уровне клетки и наличием специфических генов, которые контролируют этот процесс.
Существует несколько регуляторов апоптоза, одним из них происходит при участии цитокинов. Цитокины – это белки посредством которых происходит связь со специфическими рецепторами на клетках-мишенях и происходит регуляция их дифференцировки и пролиферации. Процесс апоптоза запускается в момент приближения специфического рецептора к его лиганду – экстрацеллюлярному белку смерти (TNF-a, FasL, TRAIL, Apo-3L). Наиболее изучен FasL лиганд, который обычно прикрепляется на активированные Т-лимфоциты и NK-клетки при взаимодействии со специфическими рецепторами APO1/CD95/Fas клетки. В тестикулах и тканях глаза FasL обеспечивает защиту от аутоиммунного повреждения собственных клеток. Принцип действия сводится к тому, чтобы активировать специфическую протеазу – каспазу 8, которая в свою очередь запускает процесс ЗКГ . Альтернативным путем является митохондриальный путь активации апоптоза при участии белков семейства Bcl-2. Этот путь апоптоза начинается с повреждения ДНК или действия на клетку токсических агентов. Ключевым событием это пути является повышение проницаемости наружной мембраны митохондрий, которое характеризуется выходом апоптогенных белков (цитохром С, прокаспаза -2,-3, и -9, AIF (фактор индуцирующий апоптоз) из межмембранного пространства в цитоплазму клетки за счёт разрыва митохондриальной мембраны или открытия высокопроницаемых каналов на внешней мембране митохондрий.
Важнейшим “рецептором” повреждения ДНК является так называемый «страж генома» - белок p53. Обычно этот белок находится в неактивном состоянии и активируется вследствие гипоксии, активации онкогенов, повреждения ДНК или воздействия других цитотоксических агентов. Роль гена в процессе ЗКГ очень важна, так как причиной развития 50 % опухолей является мутация гена p53. Регуляция апоптоза белком p53 происходит несколькими способами: активация генов Bax или Bid; активация образования свободных форм кислорода, что приводит к перекисному окислению, которое приводит к высвобождению цитохрома С из митохондрий; индуция мРНК Fas, а также выход Fas на поверхность клетки из аппарата Гольджи; стимуляция образования APAF-1; стимуляция экспрессии каспазы 6; переход части молекул самого гена p53 в митохондрии с последующим выходом цитохрома C .
Существенным механизмом апоптоза является синтез и активация проапоптических соединений семейства Bcl-2. Впервые белок семейства Bcl-2 описанные как онкоген при В-клеточной лимфоме, который привел к образованию опухолевого клона за счет увеличения выживаемости опухолевых клеток. . В настоящее время семейство Bcl-2 включает в себя группу белков со сходными морфологическими составами и делится на две группы: индукторы апоптоза и ингибиторы апоптоза. Решение о гибели клетки принимается на основании относительного преобладания активных супрессоров или промоторов апоптоза. Механизм действия основывается на действии проапоптических белков семейства Bcl-2, которые образуют временные мегаканалы на месте физиологических (для Ca2+, O2, Na+/К+), через которые начинает поступать цитохром С и другие факторы апоптоза. Цитохром С необходим для образования апоптосомы, в которой активируется каспаза 9.
Существует еще другой, стрессовый, путь апоптоза, который активирует каспазу 9 через комплекс Apaf-1 (апоптический протеаза-активирующий фактор). Конформационные изменения Apaf-1, индуцированные цитохромом С из поврежденных митохондрий и АТФ, позволяют привлечь профактор каспазы 9 через их общий домен. Каспаза 9 апоптосомы, в свою очередь, вызывает активацию эффекторных К(3,7), которые инициируют интенсивный протеолиз и высвобождают связанную ДНКазу, разрушающую хроматин. Особо следует отметить роль белка Bid, который является связующим звеном между двумя путями апоптоза – митохондриальный и путем «рецепторов смерти» (воздействие К8) .
В настоящее время изучение процесса апоптической гибели клетки имеет огромный интерес в медицине. Нарушение процессов физиологической смерти играет немаловажную роль в развитии патологических состояний, в том числе онкологических и аутоиммунных заболеваниях .
В настоящее время известно множество заболеваний, связанных с усилением апоптоза: фолликулярная лимфома, рак половой системы у женщин и мужчин (яичники, предстательная железа), гломерулонефрит, вирусные инфекции (аденовирус, вирус герпеса, поксвирус). А так же заболевания связанные с ингибированием процессов апоптоза: СПИД, нейродегенеративные заболевания (Альцгеймера, Паркинсона), токсические заболевания печени, мозжечковые дегенерации и т.д
Изучение механизмов апоптоза дает нам представления о развитии некоторых заболеваниях, их течении. Уже сейчас мы можем использовать эти знания для предотвращения заболеваний на различных стадиях патогенеза (коррекция и регуляция).
Апоптоз является очень важным процессом в онтогенезе каждого живого организма. Этот процесс позволяет поддерживать внутренний гомеостаз, контролировать правильный рост и развитие организма, без механизма апоптоза в нашем организме был бы хаос, многочисленность генетических изменений, беспорядочное деление клеток.
Список литературы:
1. Владимирская Е.Б. Механизмы апоптической смерти клеток / Е.Б. Владимирская// Гематология и трансфузиология. – 2002. – Т.47, №2, - С. 35 - 40.
2. Робинсон М.В. Апоптоз клеток иммунной системы / М.В.Робинсон, М.А. Труфакин// Успехи современной биологии. – 1991. –Т.3 вып. 2. – С. 246 – 259.
3. Adams J.M. Ways of dying: multiple pathways to apoptosis / J.M. Adams // Genes and Development/ - 2003. – N 17. – P. 2481 – 2495.
4. Itoh K. Central role of mitochondria and p53 in Fas-mediated apoptosis of rheumatoid synovial fibroblasts / K. Itoh, H. Hase, H. Kojima et al. // Reumatology. – 2004. – N 43. – P.277-285.
5.& Newton K. Caspases signal not only apoptosis but also antigen-induced activation in cells of the immune system / K. Newton, A. Strasser// Genes and Development. – 2003. – Vol.17, N7. – P.819 – 825.